生物化学的核心

帮助研究人员使用BioID等

生物化学核心提供专业知识、设备和技术能力的集中资源,涵盖复杂生物样品分离和分析的各种方法。这些功能包括BioID方法筛选蛋白质-蛋白质相互作用,多分析物检测和定量蛋白质,以及通过GC/MS进行脂质分析。

生物化学核心课程由儿科研究中心(美国国家图P20GM106320).

我们在下面的“常见问题”一节中回答了关于BioID的最常见问题。如果你还有问题,请与我们联系。

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服务

BioID是一种基于邻近依赖生物素化BioID资源筛选候选蛋白质-蛋白质相互作用的新方法。

核心将在以下方面提供协助:

  • 项目设计
  • bioid融合蛋白的检测
  • 生物融合蛋白表达细胞的建立与检测
  • 大规模生物id下拉
  • 安排用质谱法鉴定候选人
  • 数据分析

除了BioID, Core还将为包括TurboID在内的BioID衍生产品提供帮助。

设备

  • Agilent 7890A气相色谱仪
  • 安捷伦5977B质谱系统
  • Luminex 200多重蛋白质分析系统
  • Nicoya OpenSPR(表面等离子体共振)
  • Bio-Rad ChemiDoc MP成像仪
  • LiCor奥德赛Fc成像仪
  • BioTek Cytation 3细胞成像多模式阅读器

出版物

关于BioID

BioID是一种在活细胞中筛选近似蛋白和相互作用蛋白的方法。这是通过混杂的生物素连接酶(我们称之为BirA*)与感兴趣的蛋白质(诱饵)融合来实现的,以便在活细胞中表达。添加过量的生物素可使饵料附近的内源蛋白质高效生物化。这些生物素化蛋白(称为候选蛋白)可以通过荧光显微镜或Western blot分析进行监测,并通过质谱分离进行鉴定。候选饵的生物学相关性随后可以通过各种常规方法进行验证。

认识我们的团队

常见问题

我如何让生物素在细胞培养基中进入溶液?

我们在我们的标准组织培养基(不含血清)中制作20X生物素(Sigma cat# B4639)原液(1mM),并在1X (50uM,含血清)下使用。这种20X的溶液经过过滤灭菌,在4℃下至少可以稳定几个月。

我必须诱导调节我的BioID融合蛋白的表达吗?

一般来说,没有。我们已经生成了许多稳定的细胞系,这些细胞系组成了各种BioID融合蛋白,并将这些细胞系用于大规模的BioID下拉。通过BioID调节生物素化的最有效方法是向细胞培养基中添加过量的生物素。然而,在某些情况下,诱导表达bioid融合蛋白可能是理想的和/或必要的,例如如果该蛋白是有毒的。在使用TurboID连接酶时,强烈推荐诱导调节融合蛋白的表达。

我是否需要表达大量bioid融合蛋白来识别相互作用的候选者?

根据我们的经验,没有。尽管更多的融合蛋白可以等同于更多的内源性蛋白的生物素化,但我们能够从稳定表达bioid融合蛋白的细胞中获得大量独特的生物素化蛋白(定义为那些在对照细胞的平行下拉中未检测到的蛋白质),而我们几乎无法通过免疫荧光检测到该蛋白。

BioID生物素化的有效范围是什么?

请参阅我们关于这个主题的手稿:Kim DI, KC B, Zhu W, Motamedchaboki K, Doye V, Roux KJ。用邻近依赖生物素化方法探测核孔复合体结构。美国国家科学研究院。2014 6月17日;111(24):E2453-61。Pubmed midd: 24927568


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